1.肿瘤细胞太少怎么办？

Z: 我的样本是肿瘤原发灶、淋巴结转移灶，我的淋巴结细胞恶性细胞基本都是几十个，这样的话是因为我前期过滤太狠了，还是就是淋巴结里面恶性肿瘤细胞很少?

H: 淋巴结转移样本我之前处理过，也是有肿瘤细胞很少的情况，当然也有肿瘤细胞数较多的情况，不能一概而论。你可以试着调整一下过滤参数，再看看。比如线粒体基因占比，肿瘤样本一般高一些。如果最后还是很少，那就没办法了。

2.淋巴结里面上皮细胞都是恶性的吗？还是就一部分是恶性。就是计算的CNV来看，会有一部分上皮不是恶性。

H: 依据我的经验，淋巴结转移灶里面的上皮细胞基本都是肿瘤细胞。我不是医学背景，我认为淋巴结不太可能有上皮细胞，所以只有可能是转移过来的肿瘤细胞。另，我之前应该说过，即使是肿瘤细胞也不一定会有CNV。

3.从CNV热图检查一下问题2

H: 你能给我看看你的淋巴结上皮细胞的CNV吗？

Z: 单独的淋巴结上皮细胞CNV? 我没有画这个图，我是全部上皮一起做的，然后计算了CNVscore。

H: 建议你还是一个样本一个样本做

Z: 每个样本单独去跑infercnv?

H: 是的

Z: 那还是只跑上皮细胞，还是每个样本所有细胞都一起跑

H: 只跑上皮细胞，跑的时候，以配对的正常样本的正常上皮细胞作为对照

Z: 我们有的样本没有配对的癌旁，基本都是肿瘤组织，只有三个配对癌旁。

H: 那就用别的病人的癌旁，没有配对的话，可以这样勉强做，总比不加对照准确

4.推断CNV时，如何选择参照细胞？

Z: 可以用同一个样本的免疫细胞或者fibro作为参照吗？我看有的文章是以endo 和fibro作为参照

H: 也可以，都有文章，你得都试一下，才能从图中看出哪种好

5.对癌旁有了新认识

Z: 其实我们从临床角度来说，如果取的是癌旁，不一定里面的上皮都是正常组织，可能也会有恶性上皮细胞

H: 这种情况应该很少吧。我之前也问过几个医学生朋友，跟我说这种情况很少。既然取癌旁，肯定不希望有肿瘤细胞，只是取样的时候谁也说不好取得有偏差。

Z: 癌旁是有定义的，距离肿瘤组织2cm以内。但我们临床实际取样很多时候就直接取的很远的正常组织

H: 哦哦，我明白了。严格的两公分以内的癌旁是可能有肿瘤细胞浸润的。很远的正常组织就不太可能有肿瘤细胞了

6.inferCNV是全部样本一起做，还是一个一个做？选什么细胞做参照？

Z: 其实我有一点不太明白，我们按照每个样本去跑CNV，目的应该就是去除一些其他技术因素 、患者特异性或者批次导致的影响吧，但如果以其他样本的正常上皮作为参照，这样应该也不准确吧

H: 你刚才问的选什么细胞做参照的问题，其实最理想的情况还是选同一个病人的“癌旁”样本，如果没有的情况就只能退而求其次了。是选其他病人的“癌旁”还是同一病人的免疫/基质细胞作为参照，我之前做过一些尝试，我自己的一些体会是，以T细胞为例（内皮、成纤维我没试过，给不出经验），以它作为参照，总能在某几个染色体区段上看到扩增或是缺失，这种现象在好几个病人中都出现了，后来发现并不是真正的CNV，只是上皮细胞相较于T细胞本来就存在的差异表达，如果不清楚这一点很容易将这些区段误认为是明显的CNV。以其他病人的“癌旁”作为对照，病人特异性可以不考虑，正常上皮细胞不同病人应该差不多，批次效应可能有，但实际分析下来我觉得inferCNV这一步批次的影响很小，这主要是从我分析的结果来看的（查询的细胞，确实有一些能看到CNV，有一些则表现得和参考细胞一样，几乎没有CNV），另外，这里给出一篇用别的病人的“癌旁”上皮细胞作为对照的cell research文献Single-cell transcriptomics reveals regulators underlying immune cell diversity and immune subtypes associated with prognosis in nasopharyngeal carcinoma。

Z: 你后来发现并不是真正的CNV 这个你是怎么判断的？我之前用T细胞的时候好像也遇到过这样的现象。然后我用成纤维和内皮细胞发现效果好像还不错。

我也模仿的是一篇文章里面，将一部分成纤维和内皮细胞混在上皮里面，看他们的聚类情况

H: 很多病人都有，且和已知的这种癌症的CNV对不上；再一个是已知这个区段上有一些T细胞高表达的基因。你这个看着效果还可以。如果效果可以，你就按你的做吧。

因水平有限，有错误的地方，欢迎批评指正！