转载：paired-ends 测序原理（陈云地）
问题：read 1结束之后进行read 2是一个什么原理？
先看图：
（图中的示意在细节上有少许错误。由于图片难以修改，随它去了。能够找到错误，能够想到改正错误的办法，也是一种乐趣）
以下解答基于除了HiSeq X10、X5以外的其他Illumina高通量测序平台（比如HiSeq 2500）的测序化学。HiSeq X系列平台的PE反应原理也许有所不同。由于Illumina没有公开，作者无从得知。
Read 1测序完成后，进行以下步骤：
1、碱变性。用稀的氢氧化钠溶液变性DNA双链（效果与热变性一样），使read 1测序过程中所合成的产物链（连带read 1测序引物）与模板链分开，成为单链；用缓冲液冲过FC的各条LANE，把游离的DNA链（即read 1测序的合成产物）冲走，冲出FC。
2、末端修补。在read 1测序前的cluster生成过程中，有一个片段化步骤，使用特定的酶切断了P5接头导致所有P5接头的3‘末端成为不自然的状态。现在要用PNK酶把它们修复好，使这些游离末端恢复自然状态，形成-OH基，为再一次的互补链合成作好准备。
3、再次搭桥，准备桥式PCR。模板单链与固定在FC上的、位于它附近的、末端已经修补完成的、比最开始短了一截的P5接头完成互补杂交。此时接头可以作为合成互补链（即桥式PCR）的引物起作用。这一过程可以与末端修补同时进行。P5接头之所以短了一截，是因为在read 1测序前被切断，去掉了几个碱基。
4、互补链合成。加入DNA聚合酶、dNTP、缓冲液，37°C左右保温一定时间，合成互补链。此dNTP是普通的dNTP，没有终止子修饰、没有荧光基团标记、也没有双脱氧修饰。此DNA聚合酶也是普通的聚合酶，不需要高保真，因为只有一个循环，而且模板也不长，通常也就300-500碱基左右。保温的具体温度和时间，需要Illumina研发专家告诉我们。理论上，read 2的桥式PCR只要进行一个循环就可以了。实际上进行了多少个循环，也需要Illumina的研发专家指导。
5、线性化。线性化是“使DNA分子变得单链化且同一方向单向化”的意思。用fpg试剂把P7接头内的一个特殊修饰的G碱基切断，形成一个单链缺口，使DNA模板链在3’端附近与FC断开。下面只要进行碱变性，就可以使它从FC上游离下来。
6、末端封闭。所有完整的游离末端都用ddNTP延伸一个碱基，防止它们在read 2的测序过程中非模板依赖地随机延伸（这时所使用的dNTP带荧光标记）而形成过高的背景噪音。P7接头的末端由于已经被fpg切断破坏，不是自然的结构，无法延伸，也不需要封闭。
7、碱变性。read 1的模板链已经被fpg切断，使用氢氧化钠溶液进行碱变性，使它从FC上游离下来，然后被缓冲液从FC里冲走，只留下新合成的互补链作为read 2测序的模板。
8、Read 2测序引物杂交。Read 2测序引物在新合成的互补链（模板分子）的5‘端杂交。
9、开始read 2测序。测序长度在HiSeq 2500上是100个碱基。
10、Read 2实际测得的碱基序列在方向上与read 1是相反的，是其互补链。测序仪的软件自动把它互补过来，使之与read 1保持同一个方向，方便后续的数据分析。